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禽流感病毒RT-PCR检测技术的研究与应用
禽流感病毒 PCR检测
2008/11/5
本研究依据我国禽流感流行情况，结合国内该病毒的遗传演化规律，在HA基因全片段范围内设计多对引物，通过分析、比较现地流行毒株的覆盖情况，确定适合于我国禽流感流行毒株的RT-PCR引物，建立H5、H7、H9、N1、N2亚型RT-PCR方法；针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的N1、N2亚型神经氨酸酶基因建立一种RT-PCR鉴别方法，建立N1、N2神经氨酸酶亚型鉴别RT-PCR方法；进一步扩展建立了以M...
该研究建立了针对禽流感型特异的和H5、H7、H9及N1、N2特异的RT-PCR快速检测和分型新技术。用H5、H7、H9、N1、N2亚型RT-PCR方法检测H1-H15血凝素亚型N1-N9神经氨酸酶亚型禽流感病毒，只对相对应亚型病毒出现预期大小的PCR扩增片段，其它亚型禽流感病毒及其他禽病病毒没有假阳性结果，表明H5、H7、H9、N1、N2亚型RT-PCR检测方法具有亚型特异性。M基因引物可以扩增H...
禽流感、新城疫和传染性支气管炎RT-PCR诊断试剂盒的研究
禽流感 新城疫 聚合酶链反应
2008/11/5
该项目对所检测的三种疫病(禽流感、新城疫和传染性支气管炎)从整体上进行一些特殊但不苛刻的设计使得客户可以在普通RT-PCR、Sybr Green荧光RT-PCR、TaqMan荧光 RT-PCR等模式中自由选用适合自己的检测模式。此外客户可以自己决定一次检测一个病还是几个病，并且同时检测几个病时各反应之间不相互干扰。目前，此项目已在本实验室应用以久，并在山东、江苏等地推广应用。
SYBR GreenI模式荧光RT-PCR鉴别新城疫病毒毒力
鸡 新城疫病毒 SYBR Green I模式 荧光RT-PCR 毒力
2008/10/27
【方法】根据NDV的F蛋白裂解位点附近的序列，设计分别对应于NDV强毒和弱毒的两对引物，然后用SYBR Green I模式的荧光RT-PCR方法比较两对引物对同一NDV的RNA扩增效率以及扩增产物的Tm值，来区分NDV的毒力。【结果】对8株NDV进行检测并测定其鸡胚平均致死时间（MDT），荧光RT-PCR方法的检测结果和MDT测定的结果完全一致，说明此荧光RT-PCR法可用于NDV毒力检测。
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TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪脂蛋白酯酶mRNA方法的建立
猪 脂蛋白酯酶 实时定量RT-PCR TaqMan荧光探针
2008/10/27
【目的】克隆猪cDNA，作为猪LPL mRNA定量检测的标准品，建立检测方法。【方法】用RT-PCR，从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA，将纯化的LPL cDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10，提取重组质粒DNA，PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR 检测。纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度...
应用半定量RT-PCR方法，测定了9种中药成分对小鼠脾脏T细胞IL-2mRNA水平的影响。结果显示，体内注射黄芪多糖、淫羊藿多糖、当归多糖、蜂胶黄酮和黄芪皂甙能够使ConA诱导的小鼠脾T细胞IL-2mRNA水平显著升高，蜂胶多糖、板兰根多糖、人参皂甙、淫羊藿黄酮不能影响细胞内IL-2mRNA丰度；中药成分体外诱导时与体内应用时的作用效应相同，但与对照相比较，蜂胶多糖在体外能够显著促进IL-2mRN...
定量检测瘤胃纤维降解细菌的RT-PCR法
瘤胃纤维降解菌 RT-PCR 定量
2008/10/13
【目的】建立一种适用于瘤胃主要纤维降解细菌的RT-PCR定量检测方法，通过培养技术监测瘤胃纤维降解细菌在不同环境下的数量变化，为深入研究反刍动物瘤胃发酵机理以及对纤维素资源的有效利用提供技术支持。【方法】分别以Fibrobacter succinogenes、Ruminococcus flavefaciens与Ruminococcus albus 的16SrDNA为靶序列设计相应的引物，建立SYB...
库尔勒香梨脉黄病毒RT-PCR检测技术研究
库尔勒香梨 梨脉黄病毒 RT-PCR
2008/9/19
以库尔勒香梨叶片和皮层为材料 ,对总RNA提取方法进行了研究 ,从中筛选出了适合库尔勒香梨总RNA的提取方法。结果表明 ,要获得良好的RT PCR扩增 ,RT体系中dNTPs浓度、互补引物、AMV、模板的浓度要分别达到 0.1mmol·L-1、0.2 μmol·L-1、0.0 5U·μl-1、0.0 1μg·μl-1以上。此外 ,使用RNasin能有效抑制RT体系中RNase对病毒RNA的降解作用...
荧光RT-PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究
禽流感病毒 荧光聚合酶链反应 检测
2008/9/5
该课题组根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列、禽流感病毒H7及H9亚型的特有序列，开发、设计多条引物和探针序列，从中筛选敏感、特异的引物、探针，经引物、探针筛选及其最佳配比比例优化，离子浓度、循环参数、检样体积及核酸提取方法、反转录酶等各试验因子的优化，建立了快速的通用型"一步法"检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测技术和检测活禽或禽产品中禽流感病毒H7、H9亚型的荧光RT...
荧光RT-PCR快速检测高致病力禽流感病毒H5亚型
禽流感病毒 荧光聚合酶链反应 检测
2008/9/5
该课题组根据高致病力禽流感病毒H5亚型血凝素（HA）特有的基因序列，合成特异性强的引物和探针，利用荧光RT-PCR检测技术，检测方法易于标准化等优点，经引物、探针筛选及其最佳配比比例优化，离子浓度、循环参数、检样体积及核酸提取方法、反转录酶等各试验因子的优化，建立了"荧光RT-PCR快速检测高致病力禽流感病毒H5亚型"方法，将检测时间从原来的3周以上缩短为4小时；对从感染AIV H5亚型的组织脏...
荧光RT-PCR快速检测活禽和禽产品中新城疫病毒中强毒株的研究
新城疫 病毒 荧光聚合酶链反应 检测
2008/9/5
该研究根据新城疫病毒F基因序列，自主设计、合成了多对引物和探针，从中筛选出敏感性高、特异性强的一对引物和两条探针配对，建立快速检测活禽或禽产品中中强毒力新城疫病毒的荧光PCR检测技术，将检测时间从原来的3周以上缩短为4小时，且敏感性高。该成果将分子生物学技术、工程技术应用到食品安全的检测中，改变了以往除鸡胚病毒分离方法外，其它方法不能从禽肉中检出病毒的状况，对传统检测方法和科研人员的传统观念发...
运用PC基因mRNA与PC基因DNA相比缺少1个81bp内含子序列的基本原理,应用PCR技术和生物工程原理,通过1对引物,进行1次克隆,成功构建了PC基因mRNA的466bp竞争DNA模板重组质粒,PC基因mRNA与PC基因DNA可以互为内参照。为应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测糖代谢过程中PC基因mRNA水平奠定方法学基础。
【目的】探讨应激时热休克蛋白mRNA转录水平的变化。【方法】根据HSP90、HSP70和GAPDH mRNA序列，设计并合成引物，将PCR扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体，重组质粒经筛选、鉴定，体外转录出RNA，梯度稀释作为阳性模板，用于标准曲线的制定和样品检测，建立了一步法实时荧光定量RT-PCR技术平台，并用于检测长途运输猪心脏和肝脏中HSP70及HSP90 mRNA转录水平的改变。【结果...
采用LUX荧光核酸扩增技术原理，以水泡性口炎病毒（VSV）NJ、 IND型NS基因为模板分别设计并合成单标记LUX荧光引物，建立血清型特异的VSV荧光RT-PCR检测方法。试验表明，两种型特异的LUX荧光RT-PCR能分别特异地鉴定VSV血清型，对口蹄疫、猪水泡病等病毒以及对照细胞、健康动物组织RNA样品的检测结果均为阴性。对比检测试验表明，LUX荧光RT-PCR的检测敏感性比常规RT-PCR提高...
禽流感病毒RT-PCR检测技术研究与应用
RT-PCR检测技术 禽流感病毒
2008/6/13
主要完成单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
主要完成人员：王秀荣，陈化兰，于康震，李雁冰，乔传玲，刘丽玲，包红梅
起 止 时 间：2001年6月—2004年6月
获 奖 情 况：2006年黑龙江省科技进步二等奖
内 容 提 要：
本研究依据我国禽流感流行情况，结合国内该病毒的遗传演化规律，在HA基因全片段范围内设计多对引物，通过分析、比较现地流行毒株的覆盖情况，确定适合于我国禽流感流行...