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DNA聚合酶分子马达精确动态工作机理研究取得进展（图）
DNA聚合酶分子 马达 确动态工作机理
2023/1/6
从细胞最基本的各种功能原件开始，精确认识其动态工作机理，是认识生命、有效干预生命过程具备基本意义的第一步。伴随冷冻电镜技术的突破，蛋白质静态晶体结构目前能够高效获取，为突破生命科学认知局限提供了巨大便利。之后，解析蛋白质分子内部复杂部件的动态反应机理，是生命科学未来亟需突破的难题。其中，DNA/RNA聚合酶等马达分子精确动态工作机理的明晰，将为高效研发控制病毒复制的有效药物提供可行前提。遗憾的是，...
靶向山羊痘病毒DNA聚合酶基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选
RNAi 山羊痘病毒 BHK-21 抑制
2012/7/18
本研究针对山羊痘病毒基因组高度保守的DNA聚合酶区段， 选取了5个干扰靶位点。根据RNAi技术原理， 构建了包括对照在内的6个shRNA重组表达质粒， 转染细胞后接种病毒， 通过细胞毒液的TCID50测定和用实时荧光定量PCR检测siRNA重组质粒对羊痘病毒DNA聚合酶基因表达的抑制作用。结果显示， 重组表达质粒组的抑制率在63%以上， 其中以pSI-W2最为明显， 抑制率为93.8%。该研究应用...
细胞虽然拥有多种修复途径，但有些DNA损伤仍不可避免地会逃避修复而在基因组上保留下来，细胞跨损伤DNA合成的分子机制一直是DNA修复中主要的未解决问题之一.最近通过对一类结构相关性UmuC/DinB蛋白质超家族成员的研究发现它们具有DNA聚合酶功能.这类新发现的DNA聚合酶不同于经典的复制性DNA聚合酶，它们能以易误/突变(error-prone/mutagenic)或无误(error-free)...
摘要随着DNA聚合酶X家族成员数量的增加,特别是两个昆虫痘病毒（entomopoxvirus，EPV）成员的加入，家族内部的系统发育关系需要重新检查。总共37个来自不同物种的DNA聚合酶X家族成员的核心结构域序列被分析。结果显示:系统发育树呈现的家族内部系统发育关系基本上与家族成员的物种分布状态相吻合，其中，病毒成员与真核生物DNA聚合酶beta（polβ）亚群构成姐妹群，提示病毒成员可能起源于真...
摘要 测定了ＲＢ６９ ＤＮＡ 聚合酶以不正确的核苷酸（ｒＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ以及碱基不配对的ｄＮＴＰ）为底物进行聚合反应的稳态动力学常数，并与Ｋｌｅｎｏｗ 酶进行了比较．结果表明，ＲＢ６９ ＤＮＡ 聚合酶在以不正确的核苷酸为底物进行聚合反应时，其Ｋｍ 值与正确底物参入时相比有大幅度提高，而ｋｃａｔ保持不变或下降幅度较小．而Ｋｌｅｎｏｗ 酶在利用不正确的核苷酸为底物时，与正确底物参入时相比，其ｋｃａｔ...
噬菌体RB69 DNA聚合酶的表达、分离纯化和其聚合反应的稳态动力学研究
RB69 DNA聚合酶 动力学常数 参入的
2007/12/24
摘要 噬菌体ＲＢ６９外切酶活性缺失的ＤＮＡ 聚合酶突变体（Ｄ２２２Ａ／Ｄ３２７Ａ）在大肠杆菌细胞中表达，表达量达细胞蛋白总量的６９％ ．表达后经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦａｓｔＦｌｏｗ ， Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ 和ＨＴＰ三步分离纯化，纯度可达９９％ 以上．随后测定了该酶利用５种ｄＮＴＰ为底物进行聚合反应的酶促动力学常数（Ｋｍ 和Ｋｃａｔ），结果表明该酶利用ｄＵＴＰ的能力与利用ｄＴＴＰ的能力相...
利用Taq DNA聚合酶对PCR产物直接进行顺序分析
非对称性PCR扩增 Taq DNA聚合酶 直接顺序分析
2007/12/21
摘要 Taq DNA聚合酶具有反应速度快、温度作用范围广及良好的续进性等特点,可视为一种理想的DNA顺序分析酶。本文首先对非对称性PCR扩增过程中单、双链DNA产物的积累情况进行了分析,然后采用标记延伸二步法,对Taq DNA聚合酶的性质及影响因素进行分析。为进一步改进Taq DNA聚合酶测序的方法,本反应建立了“Klenow-型”的直接掺入标记同位素测序法,即在反应液中加入与标记核苷酸相应的一定...
Taq DNA聚合酶功能区域的定位
Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 功能区域
2007/12/18
摘要 通过参Ｕ法定点突变产生了ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｎ端分别缺失３个，２３５个，２８７个和４４３个氨基酸的４个缺失体，利用Ｂａｌ－３１连续缺失法产生了ＴａｑＤＮＡ聚合酶的Ｃ端分别缺失了２个、１６个、２９个、３２个、３４个氨基酸的５个缺失体．经ＤＮＡ聚合酶活性测定表明Ｎ端缺失３个，２３５个，２８７个氨基酸后活力和完整的Ｔａｑ相近，而缺失４４３个氨基酸后则失去了ＤＮＡ聚合酶活力；Ｃ端的５个缺失体都失去了Ｄ...
DNA聚合酶高保真机理的新发现及其在SNP分析中的应用
DNA聚合酶 校正 分子开关 单碱基多态性
2007/12/5
摘要高保真DNA聚合酶在遗传与进化等生命活动中具有十分重要的生理与病理意义。高保真聚合酶除具有广为人知的校正功能外,最近的实验进一步表明, 由不能及时校正或难于纠正的错配碱基引发的“关”闭DNA聚合反应的效应, 同样保证了DNA聚合反应终产物的纯度。高保真聚合酶这一“关”闭DNA聚合反应的能力, 促成了其与耐外切酶消化的3´末端碱基特异性引物共同构成一个SNP敏感性纳米级复合分子“开/...
采用具有HindⅢ和EcoRⅠ单一酶切位点的pEGFP-N1超螺旋型质粒为底物, 检测三丙二酸富勒烯(trimalonic acid C60, TMA C60)对DNA限制性酶切反应的作用. 同时以该质粒为模板, 测定TMA C60对Taq DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的影响. 酶切产物与PCR扩增产物均通过琼脂糖凝胶电泳来显示....